同田专利CN101392016A_一种高纯度大豆皂苷A和B的制备方法

专利基本信息

说明书

一种高纯度大豆皂苷A和B的制备方法

[0001] 技术领域

[0002] 本发明属大豆皂苷的制备领域，特别是涉及一种高速逆流色谱制备高纯度大豆皂苷A和B的方法。

[0003] 背景技术

[0004] 大豆营养成分十分丰富，除用于制作食用油和饲料外，还可制成豆腐、豆乳、发酵食品等大豆食品而被广泛食用。中、日、韩等东亚各国食用大豆食品的历史悠久。近年来流行病学研究发现，与欧美人相比，东亚各国的妇女更年期症状较为轻微，骨质疏松发病率较低，乳腺癌，前列腺癌等癌症以及心肌梗塞、动脉硬化等心血管疾病的发病率与死亡率也较低。据认为，这与该地区人的饮食习惯，尤其是与日常饮食中摄入的大豆食品较多有很大关系。因而，引发了研究与开发含有大豆成分的保健功能食品的热潮。大豆中的主要有效成分有：(1)大豆蛋白与大豆肽类；(2)大豆异黄酮类：现已确认的有12种，主要以3种异黄酮苷元(染料木黄酮、黄豆苷元和苷氨苷元)和它们的糖甙的形式存在；(3)大豆卵磷脂类：磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰乙醇胺(PE)；(4)大豆皂苷类：其分子是由低聚糖及齐墩果稀三萜缩合形成的一类化合物。目前使用化学法研究大豆皂苷，确认大豆皂苷元有5个种类，即大豆皂苷元A、大豆皂苷元B、大豆皂苷元C、大豆皂苷元D、大豆皂苷元E。日本学者北川勋和大久保一良对多种豆类中的大豆皂苷进行了分析，认为在完整的皂苷中，天然存在的大豆皂苷有3种，即大豆皂苷元A、大豆皂苷元B、大豆皂苷元E，其它的为DDMP组，均为水解状态下的人工产物。

[0005] 大豆皂苷A的结构式如下：

[0006]

[0007] R1＝CH2OH   R2＝β-D-GLc   R3＝H

[0008] 大豆皂苷B的结构式如下：

[0009]

[0010] 大豆皂苷是皂苷研究中起步较晚的一类，大豆皂苷具有明显的溶血作用，对人体健康不利，被视为抗营养因子，同时它具有苦味，导致大豆制品具有苦涩味。因此在豆类食品加工中总被设法除去。但近年研究表明，大豆皂苷的毒副作用很小，且具有许多对人体有益的生理功效。它可降低血中胆固醇和甘油三脂含量，可预防高脂肪膳食所造成的高脂血症，大豆皂苷通过增加SOD的含量，清除自由基，具有抗氧化和降低过氧化脂质的作用，大豆皂苷具有抑制肿瘤细胞生长的作用，可抑制血小板减少和凝血酶引起的血栓纤维蛋白形成，具有抗血栓作用。据报道，大豆皂苷对人类艾滋病毒的感染有一定的抑制作用，同时还表现出对病毒感染的细胞有很强的保护作用，正是由于大豆皂苷的这些重要的生理作用，决定了它在药物方面应用的广泛前景，国外报道，大豆皂苷最有可能被开发为治疗心血管疾病的药物。

[0011] 由于大豆皂苷是极性高的酸性皂苷，为复杂的化合组分，所以纯大豆皂苷的分离提取比较困难。目前，工业上还没有大批生产，常规实验室提取方法也很难得到纯度较高的大豆皂苷单体。

[0012] 高速逆流色谱技术(High-SpeedCountercurrent Chromatography，HSCCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，其原理是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固体相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固体相中分配比例大的后被洗脱。它避免了固态支持体或载体带来的各种问题，如样品容易被吸附、损耗和变性，使其他液相色谱技术进行制备量分离时，其分配效率会明显降低，溶剂消耗量大。现在已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化，使其成为制备高纯度大豆皂苷A和大豆皂苷B的较佳手段。

[0013] 发明内容

[0014] 本发明要解决的技术问题是提供高速逆流色谱制备高纯度大豆皂苷A和大豆皂苷B的方法。本发明制得的大豆皂苷A和大豆皂苷B纯度高，该方法具有回收率高，分离量大和操作简便的特点。

[0015] 本发明的一种高速逆流色谱制备高纯度大豆皂苷A和B的方法，包括：

[0016] (1)选择上相为固定相，下相为流动相的溶剂体系，该溶剂体系由A、B、C和D四个组分构成：A组分为乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丁酯；B组分为正丙醇或正丁醇；C组分为乙醇、甲醇；D组分为水，将四组份按体积比1～5：0.5～1：1～5：5～10，将其置于分液漏斗中，摇匀静置分层，待平衡20—40分钟后，将上相和下相分开，即得该溶剂体系；

[0017] (2)先用固定相充满逆流色谱仪柱子，调节主机转速为600—1000rpm，将流动相以0.5—4ml/min的流速泵入柱内；

[0018] (3)待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；

[0019] (4)根据检测器紫外图谱接收目标成分，将流分进行浓缩冻干结晶后，得到大豆皂苷单体A和大豆皂苷B的单体。

[0020] 优选的溶剂体系为乙酸乙酯—正丁醇—乙醇—水体系。

[0021] 所述步骤(1)和(2)中的溶剂体系为乙酸甲酯—正丙醇—乙醇—水，该四组分的体积比依次为：4：0.8：2：6，主机转速950rpm，流动相泵入柱内的流速为3.0ml/min。

[0022] 所述步骤(1)和(2)中的溶剂体系为乙酸乙酯—正丁醇—乙醇—水，该四组分的体积比依次为：3：0.5：1：8，主机转速650rpm，流动相泵入柱内的流速为3.0ml/min。

[0023] 所述步骤(1)和(2)中的溶剂体系为乙酸丁酯—正丁醇—甲醇—水，该四组分的体积比依次为：4：1：1：6，主机转速750rpm，流动相泵入柱内的流速为4.0ml/min。

[0024] 所述步骤(1)和(2)中的溶剂体系为乙酸乙酯—正丙醇—甲醇—水，该四组分的体积比依次为：1：1：1：7，主机转速850rpm，流动相泵入柱内的流速为5.0ml/min。

[0025] 本发明方法采用了高速逆流色谱分离技术，是一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它克服了固态支持物或载体不可逆吸附、损耗和变性，使被分离物回收率高，理论达100％，本发明实际达到95％以上。该方法适用各种型号高速逆流色谱仪和各种含量大豆皂苷制备。

[0026] 本发明采用优选的溶剂体系、控制实验条件温度(实验条件适合温度20～40℃，在该温度范围内，温度较高时，出峰时间略有提前，分离效果变化不大，对峰形无多大影响)以及调整主机转速和流速的工艺条件，可以高效率的分离，经一次分离后可获得高纯度的大豆皂苷A和大豆皂苷B(达到98％以上)。

[0027] 有益效果

[0028] (1)本发明制得的大豆皂苷A和大豆皂苷B能够达到相当高的纯度，甚至能直接接质谱仪等仪器。

[0029] (2)该制备方法具有操作简便、分离效率高、分离量较大、回收率高以及重现性好、分离环境缓和以及节约溶剂的特点。

[0030] 具体实施方式

[0031] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0032] 实施例1

[0033] 选取乙酸甲酯—正丙醇—乙醇—水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化大豆皂苷。先按4：0.8：2：6体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡30分钟后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取100mg大豆皂苷粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为950rpm，以3.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B流分，浓缩冻干后进行结晶，其HPLC纯度达到98％以上。

[0034] 实施例2

[0035] 选取乙酸乙酯—正丁醇—乙醇—水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化大豆皂苷。实验条件适合温度为30℃，先按3：0.5：1：8体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡30分钟后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取150mg大豆皂苷粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为650rpm，以3.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B流分，浓缩冻干后进行结晶，其HPLC纯度达到98％以上。

[0036] 实施例3

[0037] 选取乙酸丁酯—正丙醇—乙醇—水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化大豆皂苷。实验条件适合温度为22℃，先按4：1：1：6体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡30分钟后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取150mg大豆皂苷粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为750rpm，以4.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B流分，浓缩冻干后进行结晶，其HPLC纯度达到98％以上。

[0038] 实施例4

[0039] 选取乙酸乙酯—正丙醇—甲醇—水体系在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化大豆皂苷。实验条件适合温度为40℃，先按1：1：1：7体积比将上述溶剂组分分配置于分液漏斗中，振摇后静置分层。待平衡30分钟后，将上相和下相分开。采用半制备型逆流色谱仪，配有聚四氟乙烯柱，20ml进样阀，柱容积为300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23检测器和N2000色谱工作站。称取100mg大豆皂苷粗样溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为850rpm，以5.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B流分，浓缩冻干后进行结晶，其HPLC纯度达到98％以上。